Problemi nel mantenimento della vitalità cellulare nel sistema di imaging delle cellule vive durante l'imaging

L'imaging di cellule vive è un importante strumento analitico nei laboratori che studiano discipline di ricerca biomedica, come biologia cellulare, neurobiologia, farmacologia e biologia dello sviluppo. L'imaging di cellule e tessuti fissati (per i quali il fotosbiancamento è il problema principale) richiede solitamente un'elevata intensità di illuminazione e un lungo tempo di esposizione; tuttavia, questi devono essere evitati quando si esegue l'imaging di cellule vive. La microscopia di cellule vive solitamente comporta un compromesso tra l'ottenimento della qualità dell'immagine e il mantenimento di cellule sane. Pertanto, per evitare un'elevata intensità di illuminazione e un lungo tempo di esposizione, le risoluzioni spaziali e temporali sono spesso limitate in un esperimento. L'imaging di cellule vive comporta un'ampia gamma di metodi di imaging con contrasto migliorato per la microscopia ottica. La maggior parte delle indagini utilizza uno dei tanti tipi di microscopia a fluorescenza, e questo è spesso combinato con tecniche di luce trasmessa, che saranno discusse di seguito. I continui progressi nelle tecniche di imaging e nella progettazione di sonde fluorescenti migliorano la potenza di questo approccio, garantendo che l'imaging di cellule vive continuerà a essere uno strumento importante in biologia.

Un'importante precauzione è quella di assicurarsi che le cellule siano in buone condizioni e funzionino normalmente mentre sono sul tavolino del microscopio con illuminazione in presenza di fluorofori sintetici o proteine ​​fluorescenti. Le condizioni in cui le cellule sono mantenute sul tavolino del microscopio, sebbene ampiamente variabili, spesso determinano il successo o il fallimento di un esperimento.

Sono disponibili vari terreni di coltura cellulare in base ai particolari requisiti biochimici delle cellule. I terreni di coltura contengono vari costituenti, tra cui amminoacidi, vitamine, sali inorganici (minerali), oligoelementi, costituenti di acidi nucleici (basi e nucleosidi), zuccheri, intermedi del ciclo degli acidi tricarbossilici, lipidi e coenzimi. Nei terreni di coltura tissutale, un passaggio importante è il controllo della concentrazione di ossigeno, del pH, della capacità tampone, dell'osmolarità, della viscosità e della tensione superficiale. Le formulazioni dei terreni disponibili in commercio spesso includono un colorante indicatore (ad esempio, rosso fenolo) per determinare visivamente il valore approssimativo del pH. Un sistema tampone di anidride carbonica e bicarbonato per la regolazione del pH è necessario per quasi tutte le linee cellulari. Le cellule devono essere coltivate in un'atmosfera che contiene una piccola quantità di anidride carbonica (solitamente 5-7%) in incubatori per controllare la concentrazione di gas disciolti. Per l'imaging di cellule vive, può essere difficile fornire un'atmosfera appropriata con anidride carbonica e questo di solito richiede camere di coltura progettate specificamente per un'atmosfera regolata. I requisiti di ossigeno possono variare tra le linee cellulari, ma i normali livelli di tensione atmosferica dell'ossigeno sono adatti per la maggior parte delle colture. Per quanto riguarda l'osmolarità, la maggior parte delle linee cellulari ha un'ampia tolleranza per la pressione osmotica, con una buona crescita a osmolarità tra 260 e 320 milliosmolari. Quando le cellule vengono coltivate in colture a piastra aperta o in piastre di Petri, è possibile utilizzare un mezzo ipotonico per far fronte all'evaporazione.